Populiarūs

Iš ateities miškų tikimasi, kad jie bus labai produktyvūs, teiks geros kokybės medienos, be to, bus atsparūs ligoms, kenkėjams, oro taršai, vėjams, sausrai ir kitiems nepalankiems veiksniams. Tokie miškai, net ir padidėjus medienos bei kitų miško produktų poreikiui, leistų išsaugoti natūralius miškus ateities kartoms. Tad ieškoma būdų, kaip pagerinti miško medžių savybes bei efektyviai panaudoti rinktinius medžius. Tradicines medžių savybių gerinimo technologijas (klasikinę selekciją) padeda tobulinti naujesni biotechnologijos metodai, o jų plėtotė daug priklauso nuo galimybės auginti augalus izoliuotose audinių kultūrose, kurios tampa vis svarbesnės ir miško vegetatyviniam dauginimui. Dauguma šiuolaikinių medžių biotechnologijos metodų yra neatsiejami nuo audinių kultūros. Šiuo terminu paprastai įvardijamas izoliuotų organizmo dalių auginimas ant dirbtinės maitinamosios terpės. Dažniausiai audinių kultūrai stengiamasi sukurti sterilią aplinką uždaruose stikliniuose ar plastikiniuose induose (pavyzdžiui, mėgintuvėliuose). Auginimas in vitro sąlygomis ne tik suteikia galimybę atlikti tokias biotechnologines manipuliacijas, kurios būtų neįmanomos natūralioje aplinkoje, bet ir leidžia efektyviau tirti įvairius fiziologinius bei biocheminius procesus, minimalizuojant arba kontroliuojant aplinkos veiksnių įtaką. Augalų audinių kultūrų populiarumą lėmė palyginai anksti pastebėta atskirų augalo dalių ar kartais netgi vienos somatinės ląstelės geba išauginti naują augalą. Ši augalų savybė, vadinama totipotentiškumu, yra labai svarbi šiuolaikinei selekcijai ir biotechnologijai, kadangi ji sudaro prielaidas neribotai gauti naujus augalus iš atskirų to paties augalo dalių.

Kodėl dauginami sumedėję augalai in vitro?

Plačiausiai in vitro dauginami tie augalai, kurie sunkiai dauginasi tradiciniais būdais. Tai gali būti dekoratyviniai, sodo vaisiniai ir miško augalai, heterozinės veislės. Pasaulyje per metus in vitro kultūrose padauginama apie 800 milijonų vienetų augalų, iš kurių devynis dešimtadalius sudaro dekoratyviniai augalai. Didžiausią kiekį padaugina Europoje esančios laboratorijos. Čia yra apie 250 laboratorijų, tačiau tik 37 iš jų daugina daugiau nei po milijoną augalų per metus. Didžiausias Europos augintojas yra Olandija, kurioje įsikūrusios 67 laboratorijos bendrai išaugina 62 milijonus augalų per metus. Miško medžių biotechnologiniai tyrimai taip pat labiausiai išplėtoti Europoje, kurioje vykdoma daugiau nei trečdalis visų su tokiais tyrimais susijusių projektų (maždaug po ketvirtadalį tenka Azijai ir Šiaurės Amerikai). Miško medžių genetinės modifikacijos tyrimai atliekami beveik 40 šalių. Projektuose, susijusiuose su šiuolaikine miško biotechnologija, dalyvauja tiek valstybės įstaigos, tiek ir privačios bendrovės. Lietuvos miškų institute 2001 m. įkurtoje Molekulinės genetikos ir biotechnologijos laboratorijoje (nuo 2010 m. – Miško augalų biotechnologijų laboratorija), taip pat buvo diegiamos ir tobulinamos su miško medžių selekcija susijusios in vitro technologijos. Šiuo metu jau ištirtos ir rekomenduotos greitai augančios hibridinės drebulės masinio dauginimo in vitro sistemoje ir kloninių sodmenų auginimo technologijos, kurios, bendradarbiaujant su privačiais partneriais, vis plačiau taikomos ir praktikoje. Čia tiriamos ir daugelio kitų medžių (įvairių tuopų rūšių bei hibridų, beržo, uosio, alksnių, guobų, ąžuolo, maumedžio) mikrovegetatyvinio dauginimo galimybės.

Specifinių miško medžių biotechnologijos sunkumų (lyginant su žemės ūkio augalais) dažnai sukelia tai, kad medžiai yra ilgaamžiai augalai, tad jų tyrimams reikia daugiau laiko ir ekonominių išteklių. Be to, ne visos medžių rūšys vienodai gerai jaučiasi mėgintuvėliuose. Paprastai spygliuočių dauginimas yra kur kas sunkesnis negu lapuočių – tai lemia ilgas augimas, mažas ūglių regeneracijos ir šaknų formavimo dažnis, didelis šalutinių komponentų (fenolių, terpenų) kiekis. Taip pat reikia spręsti brandžių rinktinių medžių (tiek spygliuočių, tiek lapuočių) dauginimo audinių kultūroje problemas, kadangi geriausiai in vitro auga iš labai jaunų sumedėjusių augalų (daigų arba sėjinukų iki dvejų metų) paruošti eksplantai. Vis dėlto audinių kultūros naudojimo dažnai neįmanoma išvengti, nes daugeliui miško medžių rūšių nėra būdingas natūralus vegetatyvinis dauginimasis, o dauginimas sėklomis neleidžia palikuonyse išlaikyti atrinktų konkrečių genotipų vertingų savybių visumos. Dar viena problema, kurią padeda išspręsti mikrovegetatyvinio dauginimo audinių kultūroje sistema, yra hibridinių medžių, kurie dažniausiai apskritai nesugeba brandinti sėklų, dauginimas. 

Klonų genetinis stabilumas

Taigi vienas svarbiausių in vitro metodų naudojimo miško augalų selekcijoje tikslų yra susijęs su genetinio stabilumo išlaikymu audinių kultūroje. Tai būtina jau atrinktai vertingai augalinei medžiagai padauginti. Šiuo atveju genetinis kintamumas (skirtingai negu ląstelinės selekcijos atveju) nėra pageidaujamas, kadangi mutacijos gali eliminuoti vertingas savybes, kuriomis pasižymi būtent atrinktasis medžio genotipas. Todėl, kur tik įmanoma, vengiama kaliaus (nediferencijuotų, lengvai mutuojančių ląstelių masės) susidarymo. Masinio vegetatyvinio miško medžių dauginimo per audinių kultūrą metu gautų naujų augalų genetinis tapatumas su donoriniu medžiu turi būti patvirtinamas reguliariai atliekamais molekuliniais-genetiniais tyrimais.

Nauji augalai in vitro sistemoje gali būti regeneruojami keletu skirtingų būdų: iš egzistuojančių ir papildomų (audinių kultūroje naujai susidariusių) meristemų arba per somatinę embriogenezę (kai nauji augalai išauga iš audinių kultūroje susidariusių somatinių gemalų, struktūriškai panašių į gemalus, gaunamus susiliejus lytinėms ląstelėms). Į maitinamosios terpės sudėtį įeinančios medžiagos – vitaminai ir įvairūs augalų augimo reguliatoriai – papildomai skatina meristemų (arba somatinių gemalų – tai priklauso nuo hormonų ir cukraus koncentracijos maitinamojoje terpėje) susidarymą. Iš meristemų formuojasi organai ir galutinis in vitro sistemos produktas – mikroūgliai, kurie toliau gali būti adaptuojami ex vitro sąlygomis. Dauginimo in vitro svarbiausias privalumas yra galimybė gauti ypač didelį naujai klonuotų augalų skaičių per trumpą laiką, kadangi audinių kultūroje galima dirbtinai skatinti naujų meristemų susidarymą ir toliau panaudoti šias meristemas augalinės medžiagos dauginimo procese. Po kelių subkultivavimų gauti augalai-regenerantai pamažu adaptuojami prie natūralių augimo sąlygų (vazonėliai su substratu, šiltnamis, atviras gruntas). Mikroūglių kultūros pradžiai labiausiai tinkama medžiaga yra pavasarį besiskleidžiantys ūgliai, nors teoriškai pridėtiniai pumpurai naujų mikroūglių vystymuisi gali būti indukuojami in vitro iš įvairių eksplantų: lapų, lapkočių, tarpubamblių, žirginių, žievės kambiaus, šaknų segmentų. Vis dėlto dažniausiai sudėtinius ūglius formuoja būtent ūglių užuomazgos iš apikalinės meristemos. įvairių lapuočių medžių rūšių in vitro kultūroms auginti naudojamos terpės dažnai papildomos hormonais citokininais, ypač benzilaminopurinu. 

Fitohormonai – veikla nematoma, bet rezultatai akivaizdūs

Tinkamas fitohormonų naudojimas yra vienas svarbiausių veiksnių, lemiančių augalų dauginimo in vitro sėkmę. Fitohormonais vadinamos cheminės medžiagos, kurios, veikdamos netgi itin mažais kiekiais, reguliuoja visam augalui reikšmingų fiziologinių bei augimo procesų eigą. Izoliuotoms augalo dalims kultivuoti naudojama maitinamoji terpė gali būti papildoma vienu ar kitu ar keliais fitohormonais. Citokininai (benzilaminopurinas, zeatinas, kinetinas ir kt.) skatina pridėtinių ūglių susidarymą įvairių augalų, taip pat ir medžių, audinių kultūrose. Naudojant citokininus pavyko sukurti efektyvias įvairių miško medžių mikrodauginimo technologijas. Citokininų dėka gavus pakankamą ūglių skaičių, šie toliau po vieną perkeliami ant maitinamosios terpės be hormonų, kur sustiprėja bei išleidžia šaknis. Tokie sustiprėję ūgliai jau gali būti perkeliami adaptacijai ex vitro, t.y. į neizoliuotą (ar nevisiškai izoliuotą) ir nesterilią aplinką, kad pradėtų prisitaikyti prie lauko sąlygų. Auksinai (indolilacto, indolilsviesto ir kai kurios kitos panašios silpnos rūgštys) skatina pridėtinių šaknų susidarymą, tačiau šaknydijimui ruošiami augalai neturi būti ilgai laikomi ant maitinamosios terpės su šiais hormonais, kadangi tie patys auksinai vėliau stabdo šaknų augimą. Augalų augimo reguliatoriai taip pat būtini kaliui gauti in vitro sistemoje, tačiau čia jau reikalingi didesni auksinų bei citokininų kiekiai, kurie palaiko kaliaus ląstelių dalijimąsi bei kaliaus kultūros augimą. Pasak klasikinio modelio, morfogenezę kaliaus kultūroje reguliuoja citokininų ir auksinų santykis: citokininų vyravimas skatina ūglių, o auksinų – šaknų susidarymą. Citokininų ir auksinų santykis kaliaus kultūroje keičiamas tada, kai gautąjį kalių norima panaudoti kaip medžiagą somatinei embriogenezei ar organogenezei. Kiti fitohormonai augalų in vitro kultūrose naudojami gerokai rečiau nei citokininai ar auksinai. Giberelinais maitinamoji terpė kartais papildoma siekiant specifinių tikslų, pavyzdžiui, žydėjimo indukcijos, tačiau tai svarbiau dekoratyviniams augalams. Hormonas abscizo rūgštis įeina į vadinamosios brandinimo terpės sudėtį, kuri naudojama sužadinti somatinei embriogenezei spygliuočių kaliaus kultūrose. 

Pirmieji medžiai tyrimuose in vitro

Miško medžių biotechnologiniuose tyrimuose, kuriant naujas in vitro ir molekulines technologijas, tuopų (Populus) gentis (kuriai priklauso ir Lietuvos miškuose natūraliai auganti drebulė – Populus tremula) dėl savo biologinių savybių yra laikoma tinkamiausiu modeliu. Tuopos plačiai auginamos vidutinio klimato bei šiauriniuose regionuose ir gerai vertinamos dėl greito augimo, didelio produktyvumo, taip pat ir dėl galimybės daugelį rūšių dauginti vegetatyviškai. Tai buvo vieni iš pirmųjų miško medžių, pradėtų tirti audinių kultūroje, o intensyvūs tyrimai vykdomi nuo praėjusio amžiaus devintojo dešimtmečio pradžios (pavyzdžiui, Vokietijoje, vienoje iš pirmaujančių šalių tuopų selekcijoje, jau 1981 m. in vitro metodu buvo padauginta daugiau nei 50 tūkst. vienos naujos triploidinės drebulės formos augūnų). Tuopų audiniai pasižymi dideliu vystymosi plastiškumu, o tai leidžia daugelį in vitro technologijų tuopoms pritaikyti lengviau negu kitoms medžių rūšims. Audinių ir ląstelių kultūroje, naudojantis didele eksplantų įvairove, buvo ištirtos įvairios tuopų rūšys bei jų hibridai. 1986 m. su tuopomis sėkmingai atlikti ir pirmieji (tarp medžių) genetinės inžinerijos bandymai. Be to, juodoji tuopa (Populus trichocarpa) buvo pirmoji medžių rūšis, kurios visą genomą pavyko sekvenuoti (2004 m.), taip sudarant galimybę sparčiai plėtoti tolesnius genų ekspresijos tyrimus. Taigi daugiausia dėmesio tuopoms skiriama ir šiuo metu: joms tenka beveik pusė visų su medžiais atliekamų biotechnologinių tyrimų. Tai atspindi visame pasaulyje pastebimą susidomėjimą būtent greitai augančiais medžiais, tinkamais trumpos rotacijos želdiniams veisti.  

Populus genties atstovai (drebulės ir jų hibridai) atlieka modelinių medžių vaidmenį ir Lietuvoje, Miškų institute, vykdomuose miško medžių biotechnologijų tyrimuose. Čia buvo ištirtos sąlygos, turinčios įtakos hibridinės drebulės (Populus tremuloides × P. tremula) sodmenų auginimui in vitro metodu, bei įvaldyta drebulių mikrodauginimo technologija, kai pridėtinių ūglių formavimasis iš pirminių eksplantų (apie 1 cm ilgio sterilių stiebo atkarpų su vegetatyviniais pumpurais) skatinamas ant maitinamosios terpės, kuri papildyta citokininu benzilaminopurinu. In vitro regeneravę augalai vėliau dviem mėnesiams perkeliami į indus su durpių substratu, kad adaptuotųsi nesterilioje aplinkoje. Hibridinės drebulės atrinktų vertingiausių genotipų klonai kaupiami ir laikomi audinių kultūrose, įvertinamas jų augimas kontroliuojamomis in vitro sąlygomis ir išskiriami sparčiausiai augantys genotipai, taip pat tiriama jų genetinė struktūra, molekuliniais metodais nustatant unikaliomis savybėmis pasižyminčius genotipus.

Be mikroūglių kultūrų, tuopoms bei kitiems medžiams pritaikomos ir įvairios kitos in vitro auginimo technologijos. Norint išauginti tarprūšinius hibridus, selekcinėse programose gali būti naudojamos nesubrendusių gemalų kultūros. Iš nesubrendusių gemalų, maždaug 20 dienų po apdulkinimo įterptų į in vitro kultūrą ant terpės su citokininais, taip pat išauga daugybiniai ūgliai. Tuopoms, siekiant padidinti ūglių regeneravimo dažnį, buvo išplėtotos moteriškųjų žiedynų (žirginių) su užsimezgusiais gemalais kultūros. Iš vieno žirginio išaugintų pridėtinių ūglių kiekis priklauso nuo tuopų rūšies (gali būti 4 – 20 vienetų).

Somatinė embriogenezė kartais pasirenkama kaip alternatyva organogenezei, kai norima gauti kuo didesnį naujų augalų skaičių medžių in vitro kultūrose. Ji ypač dažnai naudojama spygliuočių kultūrose, kadangi jie nėra linkę daugintis vegetatyviškai ir todėl paprastos organogenezės in vitro rezultatai ne visada yra patenkinami. Tačiau somatinė embriogenezė gali būti panaudota ir lapuočių medžių, taip pat ir tuopų (čia ji dažniausiai indukuojama taikant lapų audinių kultūros metodą), masiniam dauginimui. Somatinė embriogenezė įvairių audinių kultūrose gali būti tiesioginė arba netiesioginė. Vykstant tiesioginei embriogenezei, ant eksplanto (pavyzdžiui, lapalakščio atpjovos) susidaro somatiniai gemalai, iš kurių išauga pumpurai bei šaknys. Netiesioginė embriogenezė vyksta, kai reprodukcinei žaliavai naudojamas iš lapų (ar kitų augalo dalių) išaugintas embriogeninis kalius, ant kurio, keičiant augimo reguliatorių santykį maitinamojoje terpėje, toliau skatinamas somatinių gemalų brendimas ir augimas.

Tuopos taip pat pripažintos modeliniais medžiais genofondui saugoti in vitro. Toks genofondo saugojimo būdas vėliau leidžia iš genetinės-reprodukcinės medžiagos, naudojant masinio dauginimo technologijas, per trumpą laiką išauginti itin didelį skaičių kloninių sodmenų, be to, in vitro saugoma augalinė medžiaga užima labai mažai vietos ir yra apsaugota nuo rizikos, kylančios dėl lauko aplinkos sąlygų. Medžių genofondo saugojimas in vitro gali būti dvejopas: trumpalaikis arba ilgalaikis. Žema temperatūra (apie 4 °C ) yra plačiai naudojama trumpalaikiam augalų, ląstelių, audinių ir organų saugojimui. Tuopų eksplantai esant žemai temperatūrai gali išlikti gyvybingi daugelį mėnesių: po 2 ir 5 metų saugojimo žemoje temperatūroje gyvybingi eksplantai sudaro atitinkamai apie 75 ir 25 procentus pirminio eksplantų skaičiaus. Tuo tarpu ilgalaikiam augalų ląstelių, audinių ir organų saugojimui gali būti naudojamas kriokonservavimo metodas – eksplantų užšaldymas ultra- žemoje temperatūroje (apie -196 °C). Šis augalų genofondo saugojimo metodas jau buvo sėkmingai pritaikytas keletui tuopų rūšių bei hibridų, taip pat ir kai kuriems kitiems medžiams. Kriokonservavimo metu eksplantas izoliuojamas ir paveikiamas krioprotektoriais (medžiagomis, apsaugančiomis ląsteles nuo jas suplėšyti galinčių vidinių ledo kristalų susidarymo), tada pamažu užšaldomas iki skysto azoto temperatūros ir laikomas skystame azote neribotą laiką.